环状RNAhsa_circ_0000400在原发性结肠癌中的表达水平及其临床诊断意义

1.1临床标本1.1.1组织标本：数据搜集时间为2016年1月至2019年12月：来源于常熟市第二人民医院普外科：对象为该科收治的56例结肠癌患者，其中所有患者还具有没有经过化疗、放疗或靶向药物治疗的特征。对于标本采取的原则则是对每一例不仅取癌组织，还采取癌旁的正常组织（距离癌组织3厘米），组织标本取出后用TIzo1浸泡后立即放入-80℃冰箱保存。患者病理切片均经常熟市第二人民医院病理科专家诊断为结肠癌，有完整的临床病理记录。56例病例中，男31例，女25例：年龄小于60岁21例，大于等于60岁35例：TNM分期I~Ⅱ期14例，Ⅲ~IV期42例：高、中分化41例，低分化15例。在采取研究的所有患者标本前，均已签署患者知情同意书。1.1.2血液标本：采取时间为2018年1月至2020年10月：来源单位是常熟市第二人民医院普外科：标本对象为该科收治的结肠癌患者：一共78例，其中男女比例分别为42与36例，年龄上小于60岁的32例，大于等于60岁46例：TNM分期I~IⅡ期25例，Ⅲ~IV期53例：高、中分化52例，低分化26例。操作标准是于手术前天早晨采血，容量为5m1,前提条件是采样对象一律没经过任何治疗。对照组标本随机选取自2020年9月在常熟市古里中心卫生院参加健康体检的人群。血液样本的储存与提取方法则是在肝素抗凝管中采用TRIzo1法提取血样中总RNA。1.2细胞株及细胞培养胞株来源是于浙江如耀生物科技有限公司采购，包括人正常结肠上皮细胞株HCoEpiC、结肠癌SW480与LOVO标准细胞株。细胞的常规培养则是在RPMI1640(含10%胎牛血清)培养基中。1.3主要试剂仪器通过采购获取主要试剂仪器，上海新贝生物科技有限公司：hsa circ0000400和luman,/Mouse 18S;南京诺唯赞生物科技股份有限公司：HiScript II ReverseTranscriptase逆转录试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒：美国Thermo公司：Trizol试剂、Nano Drop1000分光光度计：美国ABI公司：7500荧光定量PCR仪；CL-6000i全自动化学发光免疫分析仪购自深圳迈瑞公司。1.4RNA提取和QPCR对于样本的总RNA,经Trizol法提炼测定，其纯度与浓度以Nano Drop1OO0分光光度计测定，RNA标本标准为260nm/280nm处吸光度值为1.8~2.0，用HiScript IIReverse Transcriptase:逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录合成cDNA。反应体系为20μL,反应条件：42℃3min,60℃15min,85℃5min。以cDNA为模板，SYBR Green PCR试剂盒检测表达水平。反应体系为10μL,反应条件：95℃预变性5min,95℃10S,60℃30S,共40个循环。以Hluman/Mouse18S为内参，以2aa表示相对表达量。hsa circ0000400F:ACTTACCTCGACTCTTAGCTTGTCG,R:GGTCTTGTCACTTGGCATCTGG,Human/Mouse 18S F:GAACGAGACTCTGGCATGCTA,R:CACGCTGAGCCAGTCAGTGTA1.6血清CA19-9检测血清CA19-9的检测需要采用迈瑞CL-6000i全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂。1.7统计学分析利用统计软件分析研究，此处选用SPSS23.0。对于全部采集数据都使用均数士标准差的标识，组与组之间的比较通过t检验实现。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价hsa circ0000400的诊断效能。P值<0.05表示差异具有统计学意义。