制何首乌中的二苯乙烯苷类化学成分的LC-QTOF-MS鉴定

1前言1.1何首乌的概述何首乌，是一种蓼科植物中药何首乌（Polygonum multiflo一u1Thmb.)的干燥块根，含有多种药理活性成分，例如二苯乙烯苷、蒽醌类衍生物和软磷脂等，是享誉中外、延用千年的知名中药。两广地区和湖北省是何首鸟主要源产地。何首乌多为块状或不规则纺锤形，呈红棕色或红褐色，具有不规则的纵向横沟，表面不平整，有许多褶皱，整体沉重、坚实，不容易破碎，截断面的颜色为浅红色或浅黄褐色，有“云锦”图案，其味道略带苦味，些许回甘、涩口但性温。用药有生何首乌与制何首乌之分，秋季末尾等到何首乌的的茎和叶都枯萎的时候，或者在第二年的年尾还没有萌芽的时候，收获挖取块根，洗干净切成薄片后晒干，即为生何首乌，其生品能够消毒去浮肿，润滑肠道，缓解便秘。而其制品是取何首乌，以黑豆经过炖制或蒸制或酒制而成山。另外，现代药理学研究也证实，何首鸟具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗衰老和提高免疫功能等药理活性，降低血脂和神经保护，有可能治疗神经退行性疾病和降低血糖。何首乌除了抗氧化和降血脂效用外，药物机理的活性成分还包含有抗氧化黄酮类化学成分，如大黄素，芍药苷等，具有保健作用，其药效成分主要包括二苯乙烯苷类、蒽醌类以及黄酮类，二苯乙烯苷类中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-葡萄糖苷即THSG显示可调节机体各种生物活性分子通过多种途径发挥药理学作用，因此何首乌可作为中西结合治疗相关疾病的保健品或药品]。近年来，随着专家学者对何首乌的研究持续深入发展，何首乌也越来越受到业界健康养生人士的广泛关注，但制何首乌较之何首乌的研究却甚少，本文欲通过对何首乌的炮制加工品制何首乌中的二苯乙烯苷类化学成分的有效提取，分离和鉴定，进一步为后续的二苯乙烯苷含量测定提供新型的研究依据。制何首乌中的二苯乙烯苷类化合物的测定上遇到诸多困难和阻碍，研究文献显示，随着何首乌的发展与直接应用，其对肝脏的用药不良反应增多，对肝脏功能影响较大，另外，在实际临床应用中，制何首乌的应用略多于何首乌4。本文希望通过此次对制何首乌中的二苯乙烯苷类化学成分的鉴定研究，进一步提高医学界对制何首乌的有效成分的分析，更好地服务于百姓的健康，挖掘更多制何首乌中的二苯乙烯苷及其他可利用的化学成分的药用价值和利于定性定量的分析。1.2LC-QTOF-MS技术介绍和何首乌的炮制加工法生物和细胞体内的代谢组学技术，是一种新颖又复杂的分析方法，可对目标化合物进行量化研究，目前该技术在重要质量控制领域覆盖面积广，运用深远。另外，液质串联技术诞生于1970年初-1979年末，但受接口和离子化技术的制约，发展缓慢，到80年代中后期，出现了大气压离子化并使得其飞速发展，90年代出现完善的接口，并得到了仪器商品化，液相色谱质谱联用技术(LC-MS)已成为天然产物化学研究中最常用的分析方法之一，尤其是在中药材的质量控制和活性成分鉴定方面有着广泛应用。由于何首乌中的二苯乙烯苷类化学成分种类较多，传统的分离鉴定方法高效液相色谱(HPLC)在具有良好分离能力，定量准备的优点下，定性能力较弱，而质谱分析法(MS)虽灵敏度高，信息量大，但定量不准，而液质串联的方法使得液相色谱高效的分离优点和质谱的高敏感度融为一体，拥有超高效率、快速精准分析、质量范围宽、分辨率高、质量测量精度高（精确至小数点后第四位)的优点，对于复杂化合物成分，拥有排除干扰组分能力，对目标化合物鉴别能力颇高，广泛适用于验证组分错综复杂的二苯乙烯苷类中的化学成分，对重要复杂体系的定性定量分析具有明显优势。制何首乌中二苯乙烯苷类化学成分的LC-QTOF-MS鉴定，主要包括以下几个步骤：提取、分离、检测和鉴定。提取方法各式各样，如超声波提取，对于不同的成分需要选择不同的提取方法，提取效果有较大的差异。分离方法主要为层析法，如HPLC、UHPLC等，以分离出较纯的目标化合物。检测方法则是利用质谱技术对目标化合物进行检测和定量。鉴定主要是通过比对质谱数据库，制何首乌中的化合物的质谱图与数据库比较，确定目标化合物的化学式、分子量、碎片信息等。未经炮制的生何首乌具有一定药理毒性，而炮制过的何首乌在临床使用更多，目前何首乌的炮制方法有很多，主要介绍三种主流的炮制方法。黑豆汁炮制法，是将黑豆放入锅中煮4小时取汁，然后取适量何首乌片放入黑豆汁中搅拌湿润，最后放入蒸制容器中密封，直到汁液被首乌吸干，颜色呈褐色。黑豆黄酒制法，是将何首乌洗净切片，先用黑豆汁拌匀，隔水蒸8小时，焖8小时至何首乌表面变黑褐色停止，自然晾干后用黄酒拌匀，高压蒸汽8小时，自然晾干即可。黑豆生姜制法，是将何首乌放入水中浸泡48小时后切成小块，将何首乌再放入水中浸泡48小时，后用黑豆和生姜煮水浸泡，将何首乌用蒸笼蒸至褐色即可。根据大量文献和研究报道6，在企业规模化生产中用的最多的工艺是黑豆汁高压蒸制4。由于何首乌产地和炮制加工方法条件不一，无规范化的技术指南，造成何首乌有效成分的含量和测定结果随着不同炮制工艺而产生裱花，导致药材质量无法统一，,未建立符合中药材生产特点的质量评价体系，难以实现商品药材的标准化，因此，选择合适的提取工艺是何首乌药材制备中亟待解决的问题，当然，对何首乌进行质量评价的研究，还是以二苯乙烯苷类和蒽醌类主要活性成分的研究分析为主1)。1.3何首乌的研究状况与进展当今社会，随着科技的发展和人们生活质量水平的大幅提高，三餐温饱不再成为大家的主要关注点，越来越多的普通人开始关注生活品质的提高，而健康的身体，无疑是享受高品质生活的基础和前提。可现实中，大多数年轻人都处于亚健康状态，甚至不如老年人的身体状态，疲劳、食欲不振、肌肉和关节酸痛，睡眠紊乱和机体免疫力下降等，而且肥胖、衰老加速、高血压、糖尿病、心脑血管疾病等患病比率不断攀升和年轻化，大家都开始寻医问药，开始研究养生之道，特别在广东尤其流行，例如服用保健品，中医针灸，祛湿茶提升精气神，这是未来发展大健康行业的一个普遍趋势，中药材养生作为饮食疗法渐渐进入人们的视线正中央。例如我们并不陌生的中药材，当归、丁香、芡实、马齿苋、决明子何首乌等。制何首乌是何首乌的炮制加工品，具有滋补肝肾、补气血、乌发、乌须的作用，事实上，《神农本草经读》中有“久服强筋骨、益元气、延年益寿”，的记载，可见何首乌的保健作用，自古以来就被人们所公认，是一种强身健体的药物，也是人们在日常生活中，经常用来熬汤，熬制各种内调饮品的中草药之一，例如：何首乌黄精炖猪骨汤，宫寒气血虚、肾气不足的女生饮用此汤可以补肾补血，肾气足则头发乌亮有弹性，有预防改善骨质酥松和腰膝酸软等问题。1.3.1何首乌的化学成分研究进展据管淑玉等在2005年的研究结果表明，何首乌主要含有二苯乙烯苷、蒽醌和磷脂等三大类主要成分，在高淑红等52012年研究中，何首乌的化学成分有所变化，包括蒽醌类、黄酮类、二苯乙烯苷及其葡萄糖类、脂肪酸类和其他化合物类，如1,2-二羟基十九酮-3，五味子素，没食子酸甲酯，没食子酸，胡萝卜苷。随着检测水平的提高和科技的更新迭代，何首乌中的黄酮类和脂肪酸类和卵磷脂类化学成分也开始被广泛关注和研究，需要进一步挖掘其药用价值。早期研究中，制何首乌中被发现的单体化合物也逐渐增多，陈万生等61对中药制首乌（源产