小鼠胚胎成纤维细胞转分化为肝前体细胞的研究

第二军医大学博士学位论文分析显示诱导后的细胞表达成熟肝细胞的功能性标志物（Alb,G-6-P,Cyp3al1,Cyp7al)。PAS染色显示诱导后的细胞胞浆中有糖原的贮积，而葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)原位酶组织化学显示诱导后的细胞内有G-6-P的活性，说明诱导后的细胞能够分解糖原。另外，诱导后细胞的超微结构显示其胞质内细胞器较诱导前明显增多，尤其是在细胞与细胞之间存在肝细胞特征性的细胞间胆管结构。在I型胶原三维培养体系中HPCs用胆管诱导培养液培养21天后形成典型的管样分支状结构，并表达胆管上皮细胞的相关基因(CK7,CK19,ntegrin b4,Hnf6)。肝干/前体细胞最本质的特征是能够分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞，以上实验结果表明HPCs在体外能够分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞，具有肝干前体细胞的特征。iHPCs通过脾脏注射移植到延胡索酸乙酰乙酸脱氢酶(Fumarylacetoacetatehydrolase,.Fah)基因敲除(Fah)的肝脏损伤模型的小鼠肝脏内，细胞移植2个月后，小鼠肝脏内可观察到呈现正常肝窦结构Fah阳性的结节，同时Fh小鼠的肝功能衰竭有所缓解。激光捕获显微切割(Laser-capture Microdissection)获得的Fah阳性组织的TPCR检测结果表明植入的细胞在表达肝细胞特异性基因上与宿主肝细胞相似。HPC通过同样的方法移植到DDC损伤的小模型肝脏内，可参与大胆管的修复和新生胆管的形成。体内实验结果表明HPCs不仅可以植入小鼠肝脏内，而且可以在相应的肝脏微环境中分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞并参与相应结构的修复。我们首次用Hnf1b和Foxa3二个转录因子在体外将MEF重编程为肝前体细胞PCs在体外培养过程中保持了正常的核型和较强的增殖能力，可以在体内、外分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞并可再殖损伤的肝脏，且不具有形成肿瘤的能力。HPCs的获得具有重要的生物学意义，它为研究肝脏的发育、肝脏损伤后的修复及药物的筛选提供了理想的细胞模型，尤其是为肝脏疾病的细胞治疗提供了理想的细胞来源，并可有效克服异体器官中免疫排斥的医学难题。关键词：重编程，诱导性肝前体细胞，诱导分化，细胞移植-2